ACCLC >
In vitro veritas >
2001; volum 2 > art9.html
Revisió de les tècniques de genètica molecular més habituals en el laboratori clínic
O. Díez Gibert
Servei de Genètica
Hospital de la Santa Creu i Sant Pau
Barcelona
En l'estudi del DNA s'utilitzen elements indispensables (enzims de
restricció, sondes genètiques, etc.) i el fenomen de la hibridació, és a
dir, l'aparellament de seqüències de nucleòtids complementàries entre elles
mateixes.
Els enzims de restricció són endonucleases que tallen la doble cadena de
DNA en els punts en els que existeix una seqüència de nucleòtids (diana de
restricció), específica per a cada enzim i que aquest reconeix. Les sondes
són fragments de DNA que s'aparellen amb el DNA d'interès en seqüències
corresponents a un gen conegut o en zones del genoma de funció desconeguda,
però que es troba a prop o adjacent a un gen d'interès. El marcatge previ,
radioactiu o no, és útil per a la localització d'aquestes seqüències. Les
dues cadenes de DNA poden dissociar-se (desnaturalització) per escalfament
i reassociar-se in vitro per refredament. També poden formar-se híbrids
DNA-RNA. El procés de reassociació (hibridació) és altament específic i en
condicions adequades té lloc només entre cadenes, les bases de les quals
són complementàries. Les sondes s'uneixen als fragments complementaris del
DNA en estudi gràcies al procés d'hibridació.
La tècnica de transferència Southern permet la visualització de fragments
del genoma. Consisteix en tallar el DNA amb un enzim de restricció, separar
per electroforesi els fragments generats, transferir aquests a un suport
sòlid (generalment una membrana de niló) i, posteriorment, hibridar amb una
sonda marcada (amb 32P, digoxigenina, o altres). El senyal obtingut
identifica el fragment de DNA d'interès, que s'haurà desplaçat d'acord a la
seva grandària. Qualsevol variació implica algun canvi en la seqüència (un
nombre anormal de dianes de restricció) o l'absència de seqüències
específiques en el DNA en estudi.
Una tècnica bàsica en el diagnòstic molecular és la reacció en cadena per
la polimerasa o PCR (sigles de polymerase chain reaction). La tècnica de la
PCR és un mètode capaç de produir in vitro un gran nombre de còpies d'un
determinat fragment de DNA, del qual solem conèixer al menys els dos
extrems, i facilitar d'aquesta forma les manipulacions posteriors. Per això
s'usen, bàsicament dos encebadors (fragments oligonucleotídics, cada un
complementari d'un dels extrems del fragment de DNA a amplificar) i una DNA
polimerasa, capaç d'afegir a cada encebador nous nucleòtids, ja disposats
en excés en la solució. Es realitzen de forma automàtica cicles repetits
curts d'augment i disminució de la temperatura. El calor causa la
desnaturalització de la doble cadena de DNA, mentre que la seva disminució
porta a la hibridació dels encebadors a les seqüències complementàries del
DNA d'interès ja desnaturalitzat. Els encebadors s'hibriden orientats de
manera que l'addició de nous nucleòtids té lloc al llarg de la regió de DNA
flanquejada pels encebadors, duplicant-se així, la quantitat de la
seqüència original de DNA. El DNA sintetitzat és també complementari i
capaç d'unir-se de nou als encebadors. Per aquesta raó, en cada cicle de
desnaturalització-hibridació-síntesi es duplica la quantitat de DNA present
en el cicle anterior. Mitjançant uns 30 cicles s'aconsegueix un nombre
extraordinàriament alt de còpies d'un mateix fragment de DNA, amb la
possibilitat de l'anàlisi posterior de la seva seqüència, per a la
identificació de mutacions o altres variants.
La tècnica d'examen dels polimorfismes de conformació de cadena senzilla és
una de les més usuals. Consisteix en l'examen de la mobilitat
electroforètica en gels de poliacrilamida de fragments de DNA prèviament
amplificats mitjançant PCR. En cada electroforesi es compara un mateix
fragment de DNA de diferents pacients. Una mobilitat diferent de qualsevol
mostra respecte a les altres suggereix l'existència de canvis en la
seqüència de nucleòtids del fragment corresponent i s'haurà d'analitzar per
mitjà de la seqüenciació. Poden realitzar-se a més electroforesis en gels
amb un gradient desnaturalitzant, ja sigui químic o tèrmic. La mostra, DNA
de doble cadena, migra trobant-se amb un factor desnaturalitzant de forma
creixent, fins un punt en el que les dues cadenes comencen a separar-se i
s'endarrereix el seu avenç. Per tant, els canvis que pot presentar una
mostra en la seva seqüència modifiquen el punt de la seva desnaturalització
i la seva mobilitat respecte les altres.
S'han dissenyat nombroses variacions i adaptacions d'aquestes tècniques
electroforètiques, capaces de la identificació de fragments amb canvis en
la seva seqüència. En tots els casos, les mostres que presenten un patró
anòmal s'han de seqüenciar posteriorment per a caracteritzar de forma
definitiva el tipus de canvi en la seqüència.
Una altra de les tècniques utilitzades per a la detecció de mutacions és
l'estudi de la proteïna truncada. Consisteix en l'amplificació mitjançant
PCR de fragments grans de DNA, corresponents al gen en estudi, per mitjà
d'encebadors dissenyats adequadament. Posteriorment, es realitza una
incubació in vitro amb aminoàcids, un d'ells marcat, i lisats cel·lulars,
obtinguts comercialment. En aquest pas es produeix la transcripció a RNA i
la traducció final a proteïna, corresponent al fragment de DNA inicial.
Finalment, es realitza una electroforesi de proteïnes marcades i s'examina
la seva mobilitat. Si en el fragment de DNA inicial existeix una mutació
causant d'una interrupció de la traducció, la proteïna sintetitzada és de
menor longitud i migra més ràpidament en el gel. Aquesta tècnica, no
obstant, no és útil per a detectar mutacions que comportin el canvi d'un
aminoàcid per un altre, ja que en aquest cas la proteïna és anormal, però
d'igual longitud.
Per a l'estudi del RNA s'efectua la transferència Northern (anàloga a la
transferència Southern), en la que les diferents cadenes de RNA d'un grup
cel·lular o teixit es separen en una electroforesi, se transfereixen a una
membrana i s'hibriden amb la sonda corresponent. Si es desitja amplificar
un fragment específic de RNA, aquest pot usar-se com a motlle per a la
síntesi de la cadena còpia (cDNA), per mitjà d'una transcriptasa inversa.
El cDNA obtingut pot amplificar-se posteriorment amb la PCR. Aquesta
tècnica, anomenada RT-PCR (sigles de reverse transcriptase-PCR), ha estat
àmpliament utilitzada tant per a la detecció de mutacions com per estudiar
l'expressió de certs gens.
ACCLC >
In vitro veritas >
2001; volum 2 > art9.html
Citació recomanada per a aquest document:
Díez Gibert O. Revisió de les tècniques de genètica molecular més habituals en el laboratori clínic. In vitro veritas 2001;2:<http://www.acclc.cat/invitroveritas/vol2/art9.html>