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El futuro de las técnicas de bioquímica génica y sus aplicaciones
P. Alía Ramos
Servei de Bioquímica Clínica
Ciutat sanitària i Universitària de Bellvitge
L'Hospitalet de Llobregat
Desde el comienzo de la puesta en práctica del proyecto genoma humano, y
sobre todo tras anunciar que se había conseguido su completa secuenciación,
ha surgido el término genómica, a modo de superación del de genética. Y,
como prolongación lógica, también van apareciendo cada vez más los términos
proteoma —refiriéndose al conjunto de proteínas del organismo— y su
correspondiente proteómica.
El estudio de los genomas tiene como fin proporcionar el inventario de
todos los genes de un individuo, así como su modo de funcionamiento. De
momento, lo que se conoce del genoma humano es la secuencia de nucleótidos
sin más: todavía no se sabe siquiera el número de genes que existe, y mucho
menos en qué orden están ubicados. Quedan aún muchas cuestiones que deberán
resolverse: establecer las secuencias reguladoras, describir la variación
entre las especies y los grupos, definir las pautas cronológicas —y
organográficas— de expresión de RNA durante el desarrollo normal de los
individuos —y también durante los distintos procesos patológicos—,
determinar la localización subcelular de las diversas proteínas y su
interacción, etcétera.
Todos estos objetivos sólo podrán cumplirse cuando el conocimiento de los
genomas permita el conocimiento de los proteomas: es decir, del conjunto
completo de proteínas que están codificadas en los genes y que, en un
momento u otro de su vida, sirven al individuo estructural o
funcionalmente.
El conocimiento completo del genoma humano se ha comparado con el que
permitió llegar al establecimiento de la tabla periódica de los elementos
químicos, ya que es la información básica para comprender los mecanismos
bioquímicos fisiopatológicos, y posteriormente desarrollar nuevos métodos
de diagnóstico, pronóstico, prevención y tratamiento. El estudio de la
genómica humana —y su ampliación al estudio de las secuencias, estructuras
e interacciones de las proteínas— originará una medicina predictiva y
preventiva, y permitirá el diseño de tratamientos más precisos e
indiviualizados, función de que se ocupa la denominada farmacogenómica.
La ampliación de los campos de conocimiento que está teniendo lugar, se ha
podido producir gracias a la utilización de nuevos métodos de análisis,
basados en el aumento de la potencia informática. Los progresos
cibernéticos han permitido, por un lado, automatizar procesos —como la
secuenciación— imprescindibles para dar comienzo a la "era genómica", y,
por otro, mejorar la comunicación entre laboratorios y crear inmensas bases
de datos.
Entre los métodos más recientes y que más información pueden aportar en un
futuro próximo se cuentan las denominadas micromatrices —matrices cuasi
microscópicas de DNA—. Consisten en unas placas —generalmente de cristal—
de pocos centímetros cuadrados de superficie, en que se distribuyen
ordenadamente miles de puntos de DNA. Al igual que las tècnicas de
transferenca Southern y transferencia Northern, las micromatrices también
se basan en la hibridación; es decir, que se produce sobre ellas un
apareamiento entre fagmentos de DNA conocidos, y fijados al cristal, y
fragmentos desconocidos de las muestras en estudio.
Las diferencias se deben a diversos avances técnicos. Por un lado, las
tradicionales membranas de nitrocelulosa o nilón han sido sustituidas por
soportes rígidos e impermeables, como el cristal, lo que aporta ciertas
ventajas: se evita la difusión de las muestras, de modo que el encuentro de
los DNAs es más rápido, y las manchas —puntos, generalmente visualizables
por marcadores fluorescentes de distintos colores— son más nítidas y
distinguibles por los sensores; además, este material facilita la
automatización del proceso de hibridación, que consiste en diversas
incubaciones en líquido y lavados. El otro avance que ha permitido la
fabricación de micromatrices es la posibilidad de dispensar microgotas
—unos pocos nanolitros— de suspensiones de DNA, mediante máquinas
especializadas. Asimismo, se han utilizado técnicas fotolitográficas, como
las empleadas para la producción de chips informáticos, para fijar
fragmentos de DNA en superficies de unos 20 µm2, de manera que se ha podido aumentar enormemente la densidad de puntos, y no se descarta que en un
futuro pueda llegarse a registrar 108 bases en placas de 2x2 cm2.
Existen dos variantes principales de micromatrices, según el tipo de DNA
que se emplee para los puntos. Las micromatrices de expresión y los
clásicamente denominados chips de DNA.
En el primer caso, se utiliza cDNA de entre 500 y 5000 bases de longitud.
Estas moléculas proceden —por transcripción inversa— de RNAs completos o
parciales que se obtienen a partir de un material biológico variado
—tejidos, células, etcétera— para asegurar la presencia del mayor número
posible de genes expresados, o bien de genotecas de cDNA ya preparadas y de
gran representatividad. Una vez identificados los RNAs, se amplifican
mediante la reacción en cadena por la polimerasa y se fijan a la placa de
cristal. La matriz de cDNAs se hibrida con cDNAs procedentes de muestras
problema y de referencia, marcadas con diferentes fluoróforos. Los
resultados son registrados por un detector, que especifica qué tipos de
genes están expresados en cada caso. La utilidad de este método depende de
lo que sean probando y referencia. Así, se puede comparar cualquier tipo de
población —células metastásicas con no metastásicas, con un tratamiento u
otro, con una enfermedad u otra, etcétera.
En el caso de los chips de DNA, lo que se fija al soporte son
oligonucleótidos sintéticos de 20-25 bases. Cada uno representa un trozo de
un determinado gen, y se preparan de tal modo que en su posición central
incluyen una variación de una sola base —para cada oligonucleótido, hay,
pues, cuatro variantes, correspondientes a A, G, T y C. Los distintos
"puntos" de DNA contienen oligonucleótidos consecutivos en la secuencia del
gen, de 25 en 25, hasta completar su longitud total. Además, se conoce qué
posición exacta ocupa cada secuencia en la matriz, de forma que al
hibridarla con el DNA problema marcado con fluorescencia, los puntos
fluorescentes indican qué base se encuentra en cada posición. Así, se
pueden localizar variantes de genes conocidos. Sin embargo, la detección de
mutaciones por deleción o inserción requiere otros diseños. También se
pueden fijar a la matriz secuencias que contengan mutaciones conocidas (por
ejemplo, todas las de un determinado gen), para detectar cuál es la que
tiene ese gen en la muestra problema.
El equivalente en proteínas a los estudios de DNA por micromatrices, es la
identificación de las proteínas de una muestra biológica por electroforesis
bidimensional, seguida de espectrometría de masas. Para ello, es muy
importante conseguir extractos proteínicos adecuados, antes de someterlos a
una electroforesis en que la separación de las distintas proteínas se deba
tanto a su punto isoeléctrico como a su masa molar. Una vez teñidos los
geles y visualizadas las proteínas separadas, ya pueden aislarse
—recortándolas del gel—, digerirse y ser sometidas a espectrometría de
masas; tras lo cual, los fragmentos de secuencia obtenidos son ordenados y
enfrentados a una base de datos para su identificación.
Una forma de conseguir unas proteínas concretas en cantidades relativamente
elevadas, es la traducción automatizada. Conocida la secuencia de un gen,
se puede predecir la secuencia de la proteína que se derivará de él. Esto
es básico para comenzar a estudiar el proteoma. Ya existen sistemas
automatizados —y, por tanto, ex vivo— para la traducción de cDNAs y la
purificación de la proteína producida. En una misma mezcla de reacción,
tienen lugar la transcripción mediante RNA-polimerasas y la traducción
mediante ribosomas bacterianos. En teoría, la producción de proteínas es
escalable, y ofrece la ventaja de que pueden sintetizarse incluso aquellas
que in vivo serían tóxicas. Con este sistema, es mucho más sencillo
estudiar sus propiedades bioquímicas y funcionales, ya sea con propósitos
farmacéuticos o diagnósticos.
Para conocer la función de las proteínas, es esencial determinar su
conformación espacial. La cristalografía de rayos X permite estudiarlas en
tres dimensiones. Últimamente se han desarrollado sistemas
cuasiautomatizados para este tipo de análisis. El conocimiento estructural
de las proteínas también puede permitir a los investigadores diseñar
fármacos que las activen o inhiban específicamente.
El aspecto funcional de muchas proteínas se está estudiando —entre otras
maneras— mediante el denominado sistema de dihíbridos. Con él se pueden
hacer asociaciones funcionales entre distintas proteínas —como primera
aproximación antes de averiguar la función concreta, si es que la hay—; es
decir, que se puede llegar a saber qué proteínas actúan conjuntamente, por
ejemplo.
Aunque se está en el comienzo de los estudios tanto del genoma como del
proteoma, la cantidad de información que se va acumulando es tan grande,
que sólo el uso de programas informáticos sofisticados permitirá manejarlos
y proporcionará una visión de conjunto de todos los componentes. Hoy por
hoy, todos los laboratorios son consciente de que están fabricando piezas
—la mayoría de las veces sueltas— de un puzzle enorme que tardará bastantes
años en componerse.
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